ストレプトコッカス・ゴルドニイ細胞外デオキシリボヌクレアーゼSsnAを介した口腔バイオフィルムにおける種間競合

npj Biofilms and Microbiomes volume 8、記事番号: 96 (2022) この記事を引用

1299 アクセス

9 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞外 DNA (eDNA) は、歯垢を含む多くの微生物バイオフィルムの重要な構成要素です。しかし、バイオフィルム内の細胞外デオキシリボヌクレアーゼ (DNase) 酵素の役割はほとんど理解されていません。 Streptococcus gordonii は歯垢のパイオニア定着者です。今回、我々は、S. gordonii の細胞外 DNase 活性を担う細胞壁関連タンパク質である SsnA を同定し、特徴付けました。 SsnA を介した S. gordonii の細胞外 DNase 活性は、糖中での増殖後に抑制されました。 SsnA は組換えタンパク質として精製され、pH 6.5 以下では不活性であることが示されました。 SsnA は、pH 依存的に Streptococcus mutans によるバイオフィルム形成を阻害しました。さらに、SsnA はヒトの唾液中の口腔小宇宙バイオフィルムの成長を阻害しました。しかし、阻害はスクロースの添加により改善されました。これらのデータを総合すると、S. gordonii SsnA が口腔バイオフィルム内の種間競争において重要な役割を果たしていることがわかります。糖異化による培地の酸性化は、S. mutans などのう蝕原性種にとって、SsnA を介したバイオフィルムからの排除を防ぐ戦略である可能性があります。

口腔には通常、硬組織と軟組織の表面に定着する約 100 ～ 300 の異なる細菌分類群が存在します1。口腔バイオフィルム内の細菌の分類学的組成と分布は、宿主によってもたらされる種と環境間の選択的付着プロセス、競合的および相利的相互作用によって決定されます2、3、4、5。歯垢、つまり歯の表面に形成されるバイオフィルムの蓄積は、時空間的に規則正しく発生します6。獲得したエナメル質の薄膜に付着できる先駆的定着者は歯垢の基礎を築き、二次定着者をリクルートするための受容体を提供し、最終的には複雑で動的な微生物群集の発達につながります7,8。先駆的な植民者は一般に共生者であるか、口腔の健康を維持するのに有益であるとさえ考えられています2,9,10。しかし、歯垢が適切に管理されていない場合、虫歯や歯周炎が発症する可能性があります11。これら 2 つの状態は、世界中で歯を失う大部分の原因です12。病気は歯垢の組成と生化学的活動の変化に関連しており、その結果、腸内細菌叢の異常状態が引き起こされます 13,14。齲蝕の場合、過剰な食事糖摂取の頻度および/または量により、酸性および酸生成性細菌が豊富な腸内細菌叢バイオフィルムが選択され、歯の表面のpHが低下し、歯のエナメル質またはセメント質の脱灰が促進されます。病変がさらに進行すると、象牙質が破壊され、歯髄腔へ細菌が侵入します15、16。

Mitis グループ連鎖球菌などの先駆的定着菌は、ミュータンス連鎖球菌など、より酸生成性でう蝕原性の細菌の過剰増殖を制御する上で重要な役割を果たしています。たとえば、Streptococcus gordonii は、細胞のエネルギーを生成しながらアンモニアと二酸化炭素を生成することでバイオフィルムの酸性化に対抗するアルギニンデアミナーゼ (AD) システムを発現します 9、17、18、19、20。酸素の存在下では、S. gordonii および Streptococcus Sanguinis を含む Mitis 群の連鎖球菌の他のメンバーは、S. mutans の増殖を阻害する可能性がある相当量 (ミリモル) の過酸化水素 (H2O2) を生成します21。さらに、パイオニアの植民者がバイオフィルム内の結合部位をめぐって S. mutans と競合する可能性があります。 S. mutans の付着はスクロースの存在に大きく依存しており、スクロースは細胞外で代謝されて、接着とバイオフィルムのコロニー形成をサポートするグルカンを生成します 22。スクロースの非存在下では、S. mutans の接着は細胞外 DNA (eDNA) によって媒介されるようです 23。細胞外 DNA は、DNase I で処理するとバイオフィルムが分散するため、成熟 S. mutans バイオフィルムの構造的完全性にとっても重要です 24,25。最近、eDNA が混合種の歯垢を含むより複雑なバイオフィルムに存在することが示されました 26、27、28、29、30、31。特に発生の初期段階での外因性 DNase 酵素による歯垢の処理は、バイオフィルムバイオマスを大幅に減少させ、特に eDNA に依存していると思われる特定の種を選択的に枯渇させます 27,31,32。さらに、eDNA は、歯垢内での水平遺伝子伝達のための栄養源および貯蔵庫として機能します 3,16。

多くの細菌は、表面結合または分泌型のデオキシリボヌクレアーゼ (DNase) 酵素を生成します 33,34。バイオフィルムでは、細胞外 DNase は、細菌細胞の播種、eDNA 代謝回転、遺伝子の水平転移など、さまざまな機能を果たします 8,35,36,37,38。病原体では、細胞外 DNase 酵素は病原性や好中球細胞外トラップ (NET) などの宿主免疫応答の回避に関連していることがよくあります 39,40。 S. gordonii を含む多くの口腔細菌は、細胞外 DNase 酵素を産生します 33、34、41。しかし、バイオフィルムの維持や種間相互作用におけるそれらの機能はほとんど理解されていません。ここでは、S. gordonii の細胞外 DNase 活性に関与する酵素を同定し、特徴付けました。さらに、我々は、S. mutans バイオフィルム、またはヒトの口腔細菌によって形成されるより複雑な混合種バイオフィルムの発生に対するこの酵素の影響を調査しました。

S. gordonii DL1 および S. mutans GS-5 バイオフィルムのマトリックス内の eDNA の範囲を決定するために、48 時間静的に増殖させた単一種のバイオフィルムから eDNA を抽出しました。高分子量（>10 kbp）のバンドがS. mutansバイオフィルムから単離された抽出物で観察されましたが、S. gordoniiバイオフィルムでは観察されませんでした（図1a）。断片のサイズは、S. mutans 細胞から抽出された細胞内染色体 DNA (iDNA) と同様でした。このバンドは、DNase I による抽出物の酵素処理後には観察されませんでした (補足図 1)。抽出物の NanoDrop 分光測光分析では、S. mutans バイオフィルムでは eDNA が全 DNA (iDNA + eDNA) の約 19% を占めているのに対し、S. gordonii バイオフィルムでは eDNA が全 DNA の 6% しか占めていないことが示されました。 S.ミュータンスおよびS.ゴルドニのバイオフィルムの完全性の維持におけるeDNAの役割は、事前に形成されたS.ミュータンスおよびS.ゴルドニのバイオフィルムを5μg/mLのDNase Iで37℃で1時間処理することによって調査されました（図1b）、c）。クリスタルバイオレット染色により、DNase I 処理により S. mutans バイオフィルムバイオマスが 90% 以上大幅に減少したことが明らかになりました。対照的に、S. gordonii バイオフィルムは DNase I 処理の影響を受けませんでした。バイオフィルム形成中にDNase Iを含めると、S. mutansバイオフィルムの蓄積が有意に阻害されましたが、S. gordoniiには影響しませんでした（図1d）。

S. gordonii および S. mutans バイオフィルムから単離された細胞内および細胞外 DNA (iDNA および eDNA) のアガロースゲル電気泳動。バイオフィルムをマルチウェルプレートで 48 時間増殖させ、DNA 抽出の前に遠心分離によって細胞を細胞外マトリックスから分離しました。黒い矢印はeDNAを示します。マーカー (M) は S. gordonii サンプルと同じゲル上で実行されましたが、サンプルレーンからは分離されました。 S. mutans サンプルを別のゲルで泳動しました。 b BHY培地で20時間増殖させたS. gordoniiおよびS. mutansの事前に確立されたバイオフィルムを、5μg/mL DNase Iで37℃で1時間処理しました。バイオフィルムをクリスタルバイオレットで染色し、色素を溶解し、570 nm での吸光度を測定することでバイオマスを定量しました。 c クリスタルバイオレット染色されたS. gordonii DL1およびS. mutans GS-5バイオフィルムの定量化。5μg/mL DNase Iの存在下および非存在下で増殖させた。バイオフィルムは、37°CSミュータンスバイオフィルムではなく、BHY中で20時間嫌気的に増殖させた。 d 5 μg/mL DNase I で 37 °C で 1 時間処理した、あらかじめ形成された S. mutans バイオフィルムの定量では、DNase I 処理による有意な減少が示されました (分散）、一方、S. gordonii バイオフィルムは減少しませんでした。データポイントは 4 ～ 6 回の独立した実験について示されており、バーは平均を表し、SD が示されています。データの分布はシャピロ・ウィルク正規性検定に合格したため、統計的有意性はスチューデントの t 検定を使用して計算されました。 ***p < 0.001、****p < 0.0001。

我々は、S. gordonii バイオフィルム中の eDNA レベルの低さは、細胞外 DNase 酵素の産生によるものである可能性があると仮説を立てました。 NCBI Blast を使用した S. gordonii DL1 ゲノムのスクリーニングにより、DNase I 型ドメインを持つタンパク質をコードする可能性がある 3 つの遺伝子が同定されました。これらのうち、エキソヌクレアーゼ III 酵素をコードする遺伝子と RgfB と標識されたタンパク質は、分泌タンパク質の特徴を持っていませんでした。 3 番目の遺伝子 (SGO_RS08090; GenBank Accession WP_012130709.1) は、N 末端分泌シグナルと細胞壁へのソルターゼ媒介固定のための C 末端 LPxTG モチーフを持つ推定 779 アミノ酸のタンパク質をコードしており、細胞外細胞壁を示しています。結合酵素(図2a)。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ４２のＳｓｎＡを含む他の連鎖球菌細胞外ヌクレアーゼとの相同性を考慮して、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉの推定上のＤＮａｓｅ遺伝子をｓｓｎＡ（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌＳｕｒｆａｃｅＮｕｃｌｅａｓｅＡ）と名付けた。 ssnA遺伝子がS. gordoniiの細胞外DNase活性に関与しているかどうかをテストするために、ssnAをノックアウトし、DNase Test寒天を使用して細胞外DNase活性を評価しました（図2b）。野生型 S. gordonii のコロニーの周囲にクリアランスゾーンが見られ、これらの細胞が細胞外 DNase を産生したことが示されました。対照的に、ΔssnA 変異体では細胞外 DNase 活性は検出されませんでした。天然プロモーター（S. gordonii ssnAComp）下での ssnA 遺伝子の遺伝的相補により、DNase 活性が回復しました（図 2b）。

a ssnA 遺伝子によってコードされるタンパク質のドメイン構成の概略図。推定シグナルペプチド（SP）、OBフォールド、ヌクレアーゼドメインおよびLPxTG細胞壁アンカーモチーフを含む予測ドメインの位置は、N末端からの開始および終了アミノ酸残基番号でマークされています。 b 細胞外 DNase 活性は、DNase Test 寒天を使用して評価されました。野生型 S. gordonii DL1 のコロニーの周囲にある明確なハローは、DNase 活性を示しています。 S. gordonii ΔssnA ではハローは見られませんでしたが、S. gordonii ssnAComp では細胞外 DNase 活性が回復しました。 c 細胞画分と使用済み培地は、野生型 S. gordonii、ΔssnA 変異株、および ssnAComp 株の浮遊培養物の遠心分離によって分離され、各画分のヌクレアーゼ活性は蛍光に基づく定量アッセイを使用して決定されました。黄色ブドウ球菌FH7を対照として含めた。 S. gordonii の細胞外 DNase 活性は主に細胞と関連していましたが、S. aureus DNase 活性はならし培地中でより高かったです。同量の細胞画分と上清画分を分析に使用しました。データ点は 3 つの独立した反復について示され、バーは平均を表し、SD が示されます。

S. gordonii における SsnA の産生をさらに調査するために、定量的蛍光ベースの DNase 活性アッセイを使用しました (図 2c)。 DNase 活性は、細胞結合画分および上清で測定されました。細胞外環境にDNaseを放出することが知られている黄色ブドウ球菌FH7を対照として含めた。野生型 S. gordonii では、細胞関連画分の DNase 活性が使用済み培地よりも約 5 倍高く、分泌された SsnA の大部分が細胞壁に結合したままであることを示しています。 DNase 活性は、S. gordonii ΔssnA の細胞画分および使用済み培地ではほとんど検出できませんでした。細胞外 DNase 活性は相補株で回復し、主に細胞画分に関連していました。

最初に、SsnAの発現と活性は、BHYにおけるS. gordoniiの増殖を通じてモニタリングされました（図3a）。 2時間と25時間の間で、細胞関連SsnA活性の有意差は検出されませんでした（図3b）。 16 S rRNA 遺伝子の発現と比較した ssnA の遺伝子発現も、指数関数的増殖期中安定でした。しかし、発現は定常期中に減少し、25時間後には30倍を超えて大幅に減少しました（図3c）。

a 37 °CのBHYで好気的に増殖したS. gordoniiの増殖曲線。 b 定量的蛍光アッセイを使用して2、4、6、および25時間後に測定された細胞のDNase活性が示されています。光学密度 (OD600 nm) 測定値を正規化に使用しました。 c RT-qPCRを使用してssnA発現を評価するために、増殖を通じてさまざまな時点でサンプルからRNAを抽出しました。変化倍数は 16 S rRNA 遺伝子発現に対して正規化されました。 3 つの独立した実験の結果と SE が各アッセイについて示されています。データの分布はシャピロ-ウィルク正規性テストに合格しました。通常の一元配置分散分析とダネットの多重比較を GraphPad Prism 9 を使用して実行し、統計的有意性を判定しました。 ****p < 0.0001。

ssnAのプロモーター領域の配列分析により、炭素異化産物タンパク質A（CcpA）、またはおそらくマルトース制御因子MalRタンパク質のコンセンサス結合部位が明らかになりました（補足図2a）。 CcpAまたはMalRがSsnA発現の制御に役割を果たしているかどうかを判断するために、ΔccpAおよびΔmalR変異体を構築し、糖の添加の存在下または非存在下で増殖させた株で細胞外DNase活性を評価しました（補足図2b）。 S. gordonii などのグラム陽性菌では、CCR はホスホエノールピルビン酸依存性糖:ホスホトランスフェラーゼシステム (PTS) を介した糖の取り込みに関連しています。基質特異性は、PTS の酵素 II (EII) 成分によって決定されます。 S. gordonii EIIMan 複合体は広範な基質特異性を持つようですが 43、我々は S. gordonii によって利用され、CCR を引き起こさない糖を同定できませんでした (Lin Zeng、私信)。精製 SsnA は対照として含まれており、寒天上のクリアランスゾーンで示されるように、試験したすべての条件で分解された DNA が含まれていました。野生型 S. gordonii では、糖が添加されていない場合またはガラクトース中で DNA 分解が観察されましたが、グルコース、マルトース、またはスクロース中では観察されませんでした。興味深いことに、試験した糖の存在下または非存在下で増殖させたΔccpA変異体ではDNase活性が観察されました（補足図2）。遺伝的に相補された株である S. gordonii ccpAComp は、野生型と同様の DNase 活性パターンを示しました。 malR の欠失は DNase 活性に影響を及ぼさなかったので、ここでテストした条件下ではこのリプレッサーが ssnA 発現の制御に関与していないことが示唆されます。

SsnA活性に対する糖阻害の程度を定量化するために、BHY培地またはさまざまな糖を補充したBHYで増殖させた細胞のDNase活性を、蛍光ベースのアッセイを使用して測定しました（図4a）。 S. gordonii DNase 活性は、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、またはイヌリンの存在下で >50% 減少しました。連鎖球菌は糖から酸を生成するため、DNase 酵素活性が培養物の pH によって影響を受けた可能性があります。定常期の S. gordonii BHY 培養物からの上清の pH は約 5.6 でしたが、ガラクトースで増殖させた培養物の pH は約 4.6 でした (図 4b)。グルコース、マルトース、フルクトースまたはイヌリンを用いて増殖させた培養物では、pH がさらに 4 ～ 4.2 に低下しました。 DNase 活性に対する低 pH の影響を評価するために、BHY を HCl の添加により pH 5.5 に調整し、S. gordonii 細胞を定常期まで培養するために使用しました。増殖後の最終 pH は約 4.2 で、酸性化 BHY で増殖させた細胞では DNase 活性はほとんど検出されませんでした (図 4)。

a BHY または BHY + 2% (w/v) 糖: グルコース (BHYG)、マルトース (BHYM)、ガラクトース (BHYGal)、フルクトース (BHYF)、またはイヌリン (BHYI) で増殖させた S. gordonii DL1 の細胞外ヌクレアーゼ活性。酸性培地BHY/HCl (HClでpH 5.5に調整したBHY)中で増殖させたS. gordonii細胞の細胞外DNase活性を赤線で区切って示す。データ点は 3 つの独立した反復について示され、バーは平均を表し、SD が示されます。 b BHY、BHY + 糖、または BHY/HCl 中で定常期まで増殖した後の培養物の pH。 c S. gordonii DL1 一晩培養物を回収し、pH 7.1 (青線)、5.5 (赤線)、または 4.5 (マゼンタ線) の緩衝液に再懸濁しました。 2時間後(赤矢印)、細胞を回収し、PBS(pH7.1)またはクロラムフェニコール(Chlm;12.5μg/mL;明緑色の線および暗緑色の線)を添加したPBS(pH7.1)に再懸濁した。細胞関連 SsnA の DNase 活性が示されています。データ点は 3 つの独立した反復について示され、バーは平均を表し、SD が示されます。光学密度 (OD600 nm) 測定値を各アッセイの正規化に使用しました。

アッセイは細胞を洗浄し、pH 7.1のPBSに再懸濁した後に実施したため、SsnA活性に対する低pHの影響は酵素阻害によるものではないと仮説を立てました。 SsnA活性のpH媒介低下をさらに調べるために、S. gordonii DL1を中性または酸性緩衝液中でインキュベートし、タンパク質合成阻害剤クロラムフェニコールの存在下または非存在下でpH 7.1に移しました（図4c）。総 DNase 活性は、pH 7.1 でインキュベートした細胞よりも、pH 4.5 または 5.5 でインキュベートした細胞の方が低かった。 pH 7.1 への移行後、pH 4.5 緩衝液中でインキュベートした細胞では SsnA 活性が増加しました。 SsnA 活性の回復はクロラムフェニコールの存在下で損なわれ、酵素活性を回復するには新たなタンパク質合成が必要であることを示しています。 pH 5.5 で 2 時間インキュベートした細胞では、pH 7.1 に移行すると、SsnA 活性はわずかに増加しましたが、有意ではありませんでした。クロラムフェニコールの存在下では、pH 7.1 に移行した後も SsnA 活性は減少し続け、活性酵素が回復していないことを示しました。

酵素活性をより詳細に特徴付けるために、SsnA を GST タグ付き構築物として精製しました。精製された構築物の同一性は、ペプチド質量フィンガープリンティングによって確認されました（補足図3）。予備実験では、GST タグをトロンビンで切断し、アフィニティー精製によって除去しました。この酵素は、GSTタグの有無にかかわらず活性であることが示されました（補足図4）。タグの除去によりタンパク質の収量が大幅に減少したため、その後の実験には GST タグ付き構築物を使用しました。最初に、DNase 活性に対する pH の影響を調査しました (図 5a)。至適ｐＨは７〜９．５であった。 pH 6.5未満またはpH 10.5以上では活性は検出されませんでした。

a 精製 SsnA のヌクレアーゼ活性を、pH 4.5 から 11 の範囲で定量しました。 b 定量的蛍光アッセイを使用して、SsnA の DNase 活性を、さまざまな濃度の Mn2+、Ca2+、Mg2+、および Zn2+ の存在下でテストしました。酵素を含まないネガティブコントロールを示します。すべてのパネルにおいて、点またはバーは 3 つの独立した実験からの平均を示し、SE が示されます。

ヌクレアーゼは二価金属補因子に依存することがよくあります44。 SsnA の誘導結合プラズマ質量分析 (ICP-MS) 分析では、精製されたタンパク質に関連する金属イオンは検出されませんでした。 SsnAに好ましい金属補因子を決定するために、Mn2+、Ca2+、Mg2+またはZn2+の存在下でSsnAの酵素活性を試験した（図5b）。金属が添加されていない場合、SsnA 調製物では DNase 活性は検出されませんでした。 10 μM MnCl2、20 μM CaCl2、40 μM MgCl2、または 40 μM ZnSO4 を添加すると、高レベルの DNase 活性が得られました。 ZnSO4 の濃度を 80 μM に増加すると、DNase はほぼ完全に不活化されました。 DNase 活性は、高濃度の MnCl2 (>1.28 mM MnCl2) でも抑制されました。

上に示したように、S. mutans GS-5 バイオフィルムは DNase I による処理に感受性がありましたが、S. gordonii バイオフィルムは感受性がありませんでした。我々は、SsnA があらかじめ形成された S. mutans バイオフィルムも分散させるのではないかと仮説を立てました。共焦点レーザー走査顕微鏡を使用すると、S. mutans バイオフィルムは SsnA での処理によりほぼ完全に除去されました (図 6a)。阻害は、一般的な pH に依存することが判明しました (図 6b)。 pH 4 または 5 では、バイオフィルムは SsnA によって除去されませんでした。対照的に、S. mutans バイオフィルムは、pH 5 で DNase I により対照バイオマス (酵素処理なし) の 40% 未満に減少しました。pH 6 では、DNase I と SsnA の両方が S. mutans バイオフィルムの減少に効果があり、バイオマスは減少しました。コントロールの 40% 未満まで。バイオフィルムの除去は pH 7 でさらに大きくなり、DNase I または SsnA での処理後にはバイオフィルムの 10 ～ 20% のみが残りました。これらの発見に基づいて、我々は、SsnAを発現するS. gordonii野生型細胞がS. mutans GS-5バイオフィルムを分散させることができるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、20時間増殖させた事前に確立されたS.ミュータンスバイオフィルムをS.ゴルドニ野生型細胞またはΔssnA細胞、または使用済み培地で処理しました（補足図5）。野生型 S. gordonii 細胞または培養上清で処理すると、S. mutans バイオフィルムバイオマスが対照の約 60% まで大幅に減少しました。対照的に、S. gordonii ΔssnA 細胞による処理では、S. mutans バイオフィルムは減少しませんでした。 S. gordonii ΔssnA 培養上清による処理後に、S. mutans バイオフィルムの小さいながらも有意な減少が観察されました (補足図 5)。全体として、これらのデータは、SsnA が S. gordonii による S. mutans バイオフィルムの除去を促進することを示しています。

PBS (コントロール) または 5 μg/mL SsnA で 37 °C で 1 時間処理した、あらかじめ確立された 20 時間の S. mutans バイオフィルムの共焦点レーザー走査顕微鏡。ヨウ化プロピジウム (20 μM) を使用して細胞を視覚化しました。スケールバーは 30 μm (左パネル) または 20 μm (右パネル) です。 b pH 4、5、6、および 7 で DNase I (5 μg/mL) または SsnA (5 μg/mL) で処理した、事前に確立された S. mutans バイオフィルムのバイオマス。定量にはクリスタルバイオレットアッセイを使用しました。データ点は 3 つの独立した反復について示され、バーは平均を表し、SD が示されます。

SsnAがより複雑な口腔バイオフィルムの発達を制御できるかどうかを判断するために、我々はデュアル入口BioFluxマイクロ流体システムを採用し、唯一の栄養源としての天然唾液の流れの下、SsnAの存在下または非存在下で口腔小宇宙バイオフィルムを成長させました。システムに未滅菌の唾液を接種してチャネルに播種しました。バイオフィルムを20時間培養し、10分ごとに画像を撮影しました（図7a;補足ムービー1）。 SsnA が含まれるチャネルの半分では、20 時間の増殖にわたって口腔小宇宙の発達の明らかな阻害が観察されました。 Yoyo-1 による細胞外 DNA (eDNA) の染色により、eDNA も SsnA の存在下で著しく減少することが示されました。バイオフィルム形成の過程で蛍光シグナルを定量化しました（図7b）。チャネルの上半分 (対照) ではバイオフィルムの発達の 20 時間にわたって eDNA レベルの一貫した増加が観察されましたが、下半分 (SsnA 添加) では、eDNA レベルは実験全体を通じて安定したままでした。

a SsnA (5 μg/mL) を含む唾液がチャネルの下半分に供給される、BioFlux デュアル入口マイクロ流体システムのチャネルで発達した口腔小宇宙バイオフィルムの視覚化。小宇宙バイオフィルムを 20 時間成長させました。 Yoyo-1 (2.4 nM) を使用してバイオフィルム内の eDNA を染色しました。 b 20 時間にわたる成長チャネルの SsnA 含有セクションおよび SsnA 非含有セクションの eDNA 蓄積の定量化。画像は 10 分ごとに撮影され、FIJI ソフトウェア内の GrayValue を使用して eDNA 量が決定されました。 c 0.3％スクロースを添加した天然唾液中で成長した小宇宙バイオフィルムの視覚化。 SsnA (5 μg/mL) は、チャネルの下半分に供給されるリザーバーに含まれていました。 eDNA 染色には Yoyo-1 (2.4 nM) が含まれていました。 d 0.3％スクロースを補充した唾液中での20時間の増殖にわたる増殖チャネルのSsnA含有およびSsnA非含有セクションのeDNA蓄積の定量化。画像は 10 分ごとに撮影され、FIJI ソフトウェア内の GrayValue を使用して eDNA 量が決定されました。 3 つの独立した反復からの平均値と標準誤差が表示されます。スケールバーは50μmです。

以前の研究では、糖がpHの低下とSsnA酵素活性の抑制につながることが示されていました（図4）。 SsnA による口腔小宇宙バイオフィルムの制御に対する糖の影響を評価するために、0.3% ショ糖を添加した唾液中で BioFlux システムでバイオフィルムを培養しました (図 7c; 補足ムービー 2)。これらの条件下では、SsnAの存在下ではバイオフィルム蓄積の減少は観察されませんでした（図7c、d）。口腔小宇宙バイオフィルムの eDNA に対するスクロースの影響をさらに調査するために、静的条件下で口腔小宇宙バイオフィルムの発達を制御することが以前に示されている Bacillus licheniformis 細胞外ヌクレアーゼ NucB を使用しました 31。 NucB の存在下では、唾液中のバイオフィルムの発達は対照と比較して強く阻害されました (図 8a、b;補足ムービー 3)。同様の阻害が、0.3％スクロースを補充した唾液中で増殖させた培養物でも観察されました（図8c、d;補足ムービー4）。まとめると、上記のデータは、eDNA が口腔小宇宙バイオフィルムの発達に重要であり、SsnA はスクロースの存在下では eDNA 依存性バイオフィルム蓄積の制御に効果がないことを示しています。

a 天然唾液中で 20 時間成長させ、マイクロ流体チャネルの下部に NucB を補充した口腔小宇宙バイオフィルム。 Yoyo-1 (2.4 nM) 色素を eDNA の視覚化に使用しました。 b 20 時間の増殖にわたって増殖チャネルの 2 つの半分で定量化された eDNA。 eDNAは、10分ごとに撮影された画像に対してFIJIソフトウェアのGrayValue決定を通じて測定されました。 c スクロース (0.3%) を補充した唾液を使用して小宇宙バイオフィルムを成長させ、NucB を成長チャネルの下半分に含めました。 d 唾液を含むスクロース（0.3％）中での20時間の増殖にわたる増殖チャネルのNucB含有半分とNucB非含有半分について定量化されたeDNA。 3 つの独立した反復からの平均値と標準誤差が表示されます。スケールバーは50μmです。

今回、我々は、S. gordonii によって産生される細胞外細胞壁関連 DNase 酵素である SsnA を同定し、特徴付けました。細胞外 DNase 酵素は、連鎖球菌の病原性種によって広く産生され、重要な病原性因子です 39、45、46、47。 S.サンギニス、ストレプトコッカス・インターメディウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・パラサンギニスおよびストレプトコッカス・ミティスを含む多くの経口共生連鎖球菌は、検出可能なレベルの細胞外DNase活性を生成します34,41。これらのうち、S. Sanguinis の細胞外 DNase のみが特徴付けられています。 SWAN (Streptococcal Wall-Anchored Nuclease) と呼ばれるこの酵素は、好中球細胞外トラップ (NET) からの脱出を媒介することが示されています 41。 S. mutans もデオキシリボースアルドラーゼ DeoC48 を使用して NET から逃れることができるという証拠があります。しかし、S. mutans による細胞外ヌクレアーゼ産生は弱いか、DNase 活性アッセイでは検出できません 34。私たちのデータは、S. mutans などの競合種によるバイオフィルム形成の調節における S. gordonii SsnA の役割を特定しました。さらに、バイオフィルム内の種間競争を媒介する SsnA の能力は、一般的な pH と糖の濃度に依存することが示されました。したがって、連鎖球菌の細胞外 DNase は歯垢バイオフィルムの安定性を維持する上で重要な役割を果たしている可能性があると考えられます。

SsnA は、DNase I 様ドメインを持つタンパク質をコードする遺伝子を S. gordonii ゲノムで検索することによって同定されました。 DNase I ファミリーには、保存されたタンパク質の折り畳みを共有する多様なヌクレアーゼおよびホスファターゼが含まれます 49。私たちの分析は、SsnAの大部分が細胞結合していることを示唆していますが、S. gordoniiのセクレトーム全体の質量分析研究により、107の分泌タンパク質の中にSsnA（SGO_1651）が存在することが明らかになりました50。したがって、酵素の一部が細胞表面から放出される可能性があります。 S. gordonii SsnA の相同体は、S. Sanguinis、S. intermedius、S. constellatus、S. anginosus、S. parasanguinis を含む広範囲の口腔連鎖球菌に存在しており (補足図 6)、この酵素が重要な役割を果たしている可能性が高いことを示しています。口腔バイオフィルムで。さらに、化膿連鎖球菌や重要な動物病原体であるS. スイス、S. equi、S. iniaeなどの病原性連鎖球菌には、より遠縁の相同体が存在します（補足図6）。

SsnA 活性は糖の存在下で大幅に低下しました。グルコースまたはグルコース含有二糖を補給すると、細胞外 DNase 活性が完全に阻害されました。 ssnA 遺伝子の上流には CRE 配列モチーフがあり、ΔccpA 変異体では制御が無効になっています。したがって、CcpA は遺伝子調節レベルで作用して、グルコースの存在下で ssnA の発現を制御している可能性があります。残念ながら、ΔccpA 変異体はブロス培養中での増殖が遅く、この株における ssnA 発現の RT-qPCR 分析から再現性のあるデータを得ることができませんでした。 CcpA による細胞外 DNase 酵素の制御は、S. suis や S. pyogenes を含む他の連鎖球菌種でも観察されています 51,52。 S. gordonii では、CCR は広範囲の糖によって誘発されますが、S. gordonii では CCR を引き起こさない糖を特定することができませんでした 43。実際、ガラクトースやラクトースなどの一部の糖は、CcpA53 に加えて複数の制御因子が関与する S. gordonii の複雑な制御応答を誘発します。ガラクトースは寒天プレートアッセイでは SsnA 活性を低下させなかったが（補足図 2）、ブロス培養では SsnA を強く抑制した（図 3）ことは興味深い。我々は、これは寒天プレート培養上でのガラクトース駆動の CcpA 媒介による ssnA 発現抑制を補う制御経路によるものである可能性があると仮説を立てています。バイオフィルムにおける ssnA 発現を制御する制御経路を特定するには、さらなる研究が必要となります。

SsnA の活性は、増殖培地の pH にも影響を受けた可能性があります。糖代謝により、増殖培地の酸性化が起こり、pH < 5.0 になります。同様に低い pH で細胞をインキュベートすると、細胞外 DNase 活性が急速に失われ、de novo タンパク質合成によってのみ回復しました。哺乳類の DNase I 酵素は最適 pH が 6.5 ～ 7 程度と比較的低い傾向にありますが、他の DNase I ファミリーのメンバーはより高い pH 条件を好みます 54。組換え SsnA の pH 活性範囲 (6.5 ～ 10.5) は、pH 5.5 ～ 9.0 で活性で、ほぼ中性の pH41 で最大活性となる S. サングイニスホモログ SWAN よりわずかに高いようです。低pH条件での組換えSsnAのインキュベーションは酵素の不可逆的な不活化を引き起こさず、酵素をより高いpHの緩衝液に切り替えると活性が完全に回復しました（補足図7）。したがって、糖または低 pH 培地中での増殖後の細胞壁結合 SsnA の不活性化は、酵素の直接阻害ではなく、主にタンパク質の代謝回転によるものと思われます。それにもかかわらず、クロラムフェニコールはタンパク質合成の広範な停止をもたらし、例えば細胞内や周囲の環境のpHに影響を与えることにより、SsnA活性に間接的に影響を与える可能性があることに注意する必要があります。

pH に加えて、金属イオンも DNase I ファミリー酵素の活性にとって重要です。例えば、S. Sanguinis SWAN の活性は、Mg2+ および Ca2+41 によって強化されます。同様に、Mg2+ または Ca2+ のいずれかが SsnA 活性を促進することがわかりました。これは、SsnA が SWAN や他の DNase I ファミリー酵素のように両方を必要とするのではなく、これらの金属のいずれかを利用できることを示唆しています。低濃度では、Mn2+ と Zn2+ も SsnA を活性化するようです。しかし、64μM以上のMn2+または40μM以上のZn2+では活性が著しく低下した。酵素または DNA 基質に関連する微量金属を除去するために、低濃度 (40 μM) のキレート剤 EDTA がこれらの実験に含まれました。 Zn2+ が EDTA から Mg2+ または Ca2+ を置換し、間接的に酵素を活性化した可能性があります。高濃度では、特に Zn2+ が SsnA の強力な阻害剤であると考えられます。これは、Zn2+55 によって阻害されるヒト DNase I を含む他の DNase I ファミリー酵素と一致しています。一方、より高い Mn2+ 濃度での活性の低下は、DNA 基質への Mn2+ の顕著な結合が酵素の認識/相互作用を妨げることによって引き起こされるのではないかと推測しています。唾液中の Zn2+ 濃度は 0.2 ～ 1.2 μM 程度ですが、Ca2+ は約 0.5 ～ 2.75 mM、Mg2+ は 7 ～ 30 μM で存在します56。これらの濃度は、口腔バイオフィルムにおける SsnA の活性を潜在的にサポートすると考えられます。

連鎖球菌バイオフィルムにおける種間相互作用の媒介における細胞外 DNase 酵素の役割は、これまで研究されていませんでした。今回、我々は、S. mutans GS-5 によって形成されるバイオフィルムの安定性が eDNA に依存していることを示しました。 NucB DNase 酵素で培養した場合、S. mutans NG8 はコントロール (NucB なし) と比較してバイオフィルムバイオマスの約 20% を生成しましたが、S. mutans UA159 はコントロールバイオマスの約 80% までしか減少しませんでした (補足図 8)。他の出版物と一致するレベル24。この現象は他の口腔連鎖球菌でも観察されていますが、なぜ一部の菌株が他の菌株よりも eDNA に依存するのかは明らかではありません。私たちのものを含め、S. mutans GS-5 の一部の実験室培養物では、pac および gbpC 遺伝子に変異があり、これにより細胞表面タンパク質 PAc (抗原 I/II) が分泌され、抗原 I/II の産生が欠如します。 GbpC (グルカン結合プロテイン C)58。 PAc および/または GbpC が S. mutans バイオフィルムの eDNA への依存性に影響を与えるかどうかを判断するには、今後の研究が必要です。

SsnA が静的な S. mutans GS-5 バイオフィルムを分散させる能力は、培地の pH に依存していました。 pH 5.0 では、抗バイオフィルム活性を保持した DNase I とは対照的に、SsnA はバイオフィルムを分散させませんでした。興味深いことに、pH 6.0 では、SsnA と DNase I はバイオフィルムを対照のレベルの約 40% に減少させ、これらの条件では両方の酵素が活性であることを示しています。対照的に、組換え SsnA は、蛍光オリゴヌクレオチドプローブに対してテストした場合、pH 6.5 以下では活性がありませんでした。バイオフィルム内の環境が低い pH59 を緩衝している可能性があります。あるいは、これは DNA 基質の性質の違いによるものである可能性があります。 SsnA が約 pH 6.0 で S. mutans バイオフィルムを制御する能力は、口腔内の条件において重要である可能性があります。これは、pH 6.0 で培養した場合、増殖した場合よりも S. mutans バイオフィルムに含まれるグルカンが少なく、eDNA への依存性が高いことが示されているためです。 pH 7.060。それにもかかわらず、pH 5.0 以下への低下は、SsnA に対する S. mutans の防御戦略を表す可能性があります。スクロースとデンプンの利用可能性が、S. mutans によるさらなる eDNA 放出と酸生成を刺激し、安定したバイオフィルムの確立につながることは注目に値します 25。一貫して、S. gordonii バイオフィルムも含む混合種バイオフィルムにおける S. mutans の増殖は、スクロースの存在下で増強されます 61,62。

SsnA の存在は、天然ヒト唾液の流れ下での混合種口腔小宇宙バイオフィルムの成長を阻害し、SsnA の抗バイオフィルム活性が S. mutans バイオフィルムに特異的ではないことを示唆しています。 S. ミュータンスに加えて、S. インターメディウスや S. サングイニスなどのいくつかの口腔微生物の単一種のバイオフィルムは、DNase 酵素による処理に感受性があることが示されています 63、64、65。口腔バイオフィルムの発達は種間の細胞間相互作用によって強く影響されるため 66、特定の種の排除は歯垢の蓄積に劇的な影響を与える可能性があると我々は推測しています。混合種の口腔バイオフィルムに対する SsnA の悪影響は、DNase I32 を使用して増殖したその場での歯垢の処理から得られた結果と一致しています。以前に、我々は、口腔小宇宙の発達中にNucB DNaseの存在がバイオマスの減少につながることを示しました67。興味深いことに、口腔バイオフィルム内の微生物の多様性も影響を受けました。 NucB の存在下で発達したバイオフィルムには、ペプトストレプトコッカス、ポルフィロモナス、プレボテラなどの嫌気性およびタンパク質分解性の晩期定着種の割合が減少しました 31。 SsnA がバイオフィルム内の特定の種を選択的に阻害するかどうかを確立するには、さらなる研究が必要です。

私たちの発見に基づいて、SsnA などの連鎖球菌の DNase の発現を標的にして歯垢の増殖を制御することが可能である可能性があると推測しています。しかし、低 pH による SsnA の阻害は、う蝕原性バイオフィルムに対するこの戦略の開発を制限する可能性があります。おそらくバイオフィルム内の微生物による酸の生成のため、SsnAはスクロースを補充した唾液中でのバイオフィルムの成長を制御するのに効果的ではなかったことに注目する。 DNA と相互作用してマトリックスを安定化できるグルカンの生成 68 も、これらの条件下での SsnA 活性の欠如に寄与している可能性があります。 SsnAの産生と活性を支配する制御機構、および歯垢の構造と微生物組成に対する口腔微生物細胞外DNaseの影響を理解することを目的としたさらなる研究は、細胞外マトリックスを標的とする複数種のバイオフィルムを制御するための新しいアプローチの開発につながる可能性がある。。

Streptococcus gordonii DL1 (Challis)、Staphylococcus aureus FH7 および Streptococcus mutans GS-5 (補足表 1) を、BHY 培地 (Brain Heart Infusion 37 g/L および 5 g/L 酵母エキス) 中で 37 °C で嫌気的に日常的に培養しました (10 Ruskinn BugBox Plus、Ruskinn Technology Ltd、Bridgend、UK 内で % CO2、10% H2、および 80% N2)。 BHY寒天(BHY培地プラス15 g/L Bacto-agar)を固体培地として使用した。必要に応じて、カナマイシン (250 μg/mL)、スペクチノマイシン (250 μg/mL)、およびエリスロマイシン (染色体挿入の場合は 10 μg/mL、プラスミドの場合は 2 μg/mL) の抗生物質を含めました。大腸菌を溶原培養液 (Melford Laboratories、イプスウィッチ、英国) 中で 200 rpm で振盪しながら 37 °C で培養しました。

細胞内 DNA (iDNA) または細胞外 DNA (eDNA) は、Kreth et al.21 の記載に従って抽出されました。 S. gordonii または S. mutans を、1L あたり 10 g のバクトトリプトン、5 g の酵母エキス、3 g の K2HPO4 および 2 g のグルコースを含む、pH 7.5 に調整された TYEG 培地中で一晩培養しました。合計 10 μL を 12 ウェルプラスチックディッシュのウェル内の 2 mL の新鮮な TYEG に移し、培養物を穏やかに揺動 (20 rpm) しながら 72 時間インキュベートし、24 時間ごとに培地を交換しました。上清を吸引し、ウェルを１ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で２回洗浄した。液体を吸引した後、さらに 1.5 mL の PBS を 1 つのウェルに添加し、組織培養スクレーパーで穏やかにこすってバイオフィルムを収集しました。 DNA 抽出に十分なバイオマスを提供するために、このサンプルを同等のウェルに移し、追加のバイオフィルムを削り取りました。合計で、4 つのウェルからのバイオフィルムが各サンプルについて結合されました。 12,000 g、4℃、30分間の遠心分離によって細胞を回収し、上清（eDNAサンプル）とペレット（iDNAを含む細胞を含む）をさらに精製するまで-20℃で保存しました。

eDNA を精製するには、等量の 25:24:1 フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加え、30 ～ 40 回転倒混和しました。 16,000 g、4 °C で 5 分間遠心分離した後、水相を収集し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール抽出を繰り返しました。さらに遠心分離した後、水相を収集し、10分の1容量の3M酢酸ナトリウム、pH5.2を加えて混合することによってDNAを沈殿させた。 3 分の 2 量のイソプロパノールを加えて混合し、16,000 g、4 °C で 10 分間遠心分離して eDNA をペレット化しました。 1mlの100%エタノールで洗浄した後、ペレットを風乾し、20μLの10mM Tris-HCl、pH8.0に再懸濁した。

iDNA を抽出するために、細胞ペレットを 150 µL のスフェロプラストバッファー (20 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2 および 26% (w/v) ラフィノース、pH 6.8 に調整) に再懸濁しました。これに、250 μg mL-1 ストックからの 1.5 μL リゾチームと 10,000 U mL-1 ストックからの 5 μL ムタノリシンを加え、サンプルを 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 1 μL プロテイナーゼ K (Epicentre MasterPure DNA 精製キット、Epicentre Biotechnologies、米国ウィスコンシン州マディソン) を含む 150 μL T&C 溶解溶液を加えて細胞を溶解し、メーカーの指示に従って DNA を抽出しました。

S. gordonii における潜在的な DNase I ファミリー相同体を同定するために、DNase I ドメインスーパーファミリーを Superfamily データベース (https://supfam.mrc-lmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi? sunid=56219)。 S. gordonii DNase I ファミリーメンバーは、「ゲノム割り当て」の下で特定されました。 ssnA 遺伝子およびプロモーター領域は、S. gordonii Challis ゲノム (GenBank アクセッション CP000725.1) から取得されました。推定上の転写因子結合部位は、PePPER69 を使用して同定されました。

細菌を、ポリスチレン９６ウェルプレート中で３連で２００μＬの培地に接種した。プレートを嫌気的に37℃で20時間インキュベートした。バイオフィルム阻害アッセイを実行する場合、接種時にウシ DNase I または GST-SsnA (5 μg/mL) を含めました。分散アッセイでは、酵素 (5 μg/mL) を 20 時間経過したバイオフィルムに添加し、37 °C でさらに 1 時間インキュベートしました。バイオフィルムの範囲は、クリスタルバイオレットアッセイを使用して定量化されました57。バイオフィルムアッセイを独立して 3 回繰り返しました。吸光度測定値間の差異の有意性は、スチューデントの 2 サンプル t 検定によって決定されました。

オリゴヌクレオチドプローブ、5' HEX-CCC CGG ATC CAC CCC-BHQ2 3' (PrimeTime プローブ Integrated DNA Technologies) を、Kiedrowski et al.70 によって記載されているように、DNase 活性の定量に使用しました。プローブ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８からなる緩衝液中の２μＭのプローブ）を、３８４ウェルマイクロタイタープレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－ One、Stonehouse、英国）および蛍光変化率（λex：530 nm、λem：590 nm）は、Synergy HT（BioTek、スウィンドン、英国）マイクロプレートリーダーを使用して37℃で30分間測定しました。

ssnA の破壊は、染色体 ssnA を aad9 スペクチノマイシン耐性決定基で置き換えることによって実行されました。 ssnA 遺伝子の隣接領域を、プライマー SsnAF1 および SsnAR1 を使用して PCR 増幅し、ssnA の 5 ' 領域に 484 bp の産物を生成し、ssnA の 3' 末端に 674 bp の産物を生成する SsnAF2 および SsnAR2 を生成しました。 aad9 遺伝子 (782 bp) は、プライマー aad9_SsnAF および aad9_SsnAR プライマーを使用してプラスミド pFW5 (補足表 1) から増幅されました。これらの PCR 反応は、Taq Reddymix (Sigma Aldrich、英国ギリンガム) を使用し、94 °C、2 分間、94 °C で 10 秒、56 °C で 30 秒、68 °C で 90 秒のサイクル条件を 35 サイクル行って実行されました。、その後 68 °C で 7 分間保持し、4 °C を保持します。 PCR産物を等モル比で混合し、Expand Long Range PCR酵素ミックス（Sigma Aldrich）を使用してプライマーSsnAF1およびSsnAR2を使用するオーバーラップエクステンションPCRで増幅しました。サーモサイクリングは次のように実行しました: 92 °C、2 分、92 °C、10 秒、56 °C、15 秒、68 °C を 10 サイクル 150 秒、92 °C、10 秒、56 °C、を 25 サイクル15 秒、68 °C で 150 秒、サイクルごとに 20 秒ずつ増加し、その後 68 °C で 7 分間保持し、4 °C を保持します。得られた生成物をS. gordonii DL1の形質転換に使用した。このために、S. gordonii をキャンドルジャー内で、1 μL mL-1 ウシ胎児血清と 0.1% (w/v) グルコース (BHY/FCS/G) を補充した BHY 培地で初期対数期 (OD600 nm ~ 0.3) まで培養しました。）。 37℃でさらに60分後、培養物を0.8mLアリコートに分注し、約1μgのPCR産物を添加した。さらに4時間インキュベートした後、培養物を希釈し、キャンドルジャー内で固化BHY培地上で36時間培養した。 ssnA遺伝子のaad9遺伝子による破壊および置換が成功したことは、DNA配列決定によって確認された。

ccpA の破壊は、ccpA を kanR カナマイシン耐性遺伝子で置き換えることにより、同様のアプローチを使用して実行されました。 ccpA の上流領域を CcpAF1 および CcpAR1 で増幅して 520 bp フラグメントを生成し、ccpA の下流領域を CcpAF2 および CcpAR2 を使用して増幅しました。 kanR 遺伝子は、pK18 ベクター (補足表 1) を鋳型として使用し、KanR_F および KanR_R プライマーで増幅されました。 Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs, Ipswich, Massachusetts, USA) を、製造業者の指示に従って、ccpA の上流および下流フラグメントを kanR 遺伝子に融合するために使用しました。得られた 1,795 bp フラグメントを S. gordonii 細胞の形質転換に使用しました。 ccpA 遺伝子の kanR 遺伝子による破壊および置換が成功したことは、DNA 配列決定によって確認されました。

malR 遺伝子の突然変異誘発は、malR を ermAM エリスロマイシン耐性カセットに置き換えることによって達成されました。プライマーmalRF1およびmalRR1を用いて、malR遺伝子の上流471bp断片を増幅した。 malRF2 および malRR2 を使用して、malR 遺伝子の下流領域 421 bp の配列を増幅しました。 malRR1 および malRF2 プライマーには、ermAMF2 および ermAMR2 プライマーに対する 17 bp の相補的配列が含まれていました。 pVA838（補足表1）からermAMカセットを増幅した後、PCR産物をオーバーラップエクステンションPCRでつなぎ合わせました。得られた生成物をS. gordonii DL1の形質転換に使用した。

遺伝子相補のために、SsnA.compFおよびSsnA.compRプライマーと、鋳型として野生型S. gordonii DL1からのゲノムDNAを使用してssnAを増幅することによって、プラスミドpssnACompを作成した。 SsnA.compF および SsnA.compR プライマーには、それぞれ EcoRI および BamHI 制限酵素部位が含まれていました。アンプリコンをBamHIおよびEcoRIで消化し、同様にBamHIおよびEcoRI(New England BioLabs)で消化したpDL276ベクター(補足表1)に連結した。 pssnAComp の構築が成功したことは配列決定によって確認され、これを使用して S. gordonii ΔssnA 変異体を形質転換し、遺伝的に相補された株 S. gordonii ssnAComp を生成しました。

プラスミド pccpAComp は、parcRComp71 の arcR 遺伝子を ccpA 遺伝子で置き換えることによって生成されました。プライマー CcpA_compF および CcpA_compR を使用して、野生型 S. gordonii ゲノム DNA をテンプレートとして使用して ccpA 遺伝子を増幅し、1048 bp フラグメントを生成しました。 Lin-vecF および Lin-vecR プライマーを使用して、parcRComp プラスミドをテンプレートとして使用して線状ベクターを作成し、5797 bp の線状ベクターを生成しました。 In-Fusion HD PCR ライゲーションクローニングキット (Clontech Laboratories、米国カリフォルニア州マウンテンビュー) を使用して、ccpA フラグメントをベクター骨格に融合して、pccpAComp を生成しました。プラスミド pccpAComp の完全性は配列決定によって確認され、pccpAComp を使用して S. gordonii ΔccpA を形質転換し、S. gordonii ccpAComp を生成しました。

日常的な遺伝子操作は、Sambrook et al.72 によって記載され、以下で説明されるプロトコールを使用して実行されました。プラスミドとプライマーは補足表 1 および補足表 2 に記載されています。

SsnA は、グルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) 融合構築物としてクローニングされました。 GSTタグは必要に応じて切断されました。 C 末端 LPxTG 細胞アンカーモチーフと N 末端分泌シグナルドメインを除いた ssnA 遺伝子を、プライマー ssnA_Pf7 および ssnA_Pr7 を使用して増幅し、2150 bp の産物を作成しました。この生成物を pGEX-KT プラスミド (補足表 1) にクローン化し、大腸菌 DH5α に形質転換しました。形質転換のために、大腸菌を 50 mL LB で初期対数期 (OD600 nm ~ 0.3) まで培養し、5000 rpm で 5 分間回収し、ペレットを 20 mL の氷冷 50 mM CaCl2 に懸濁することにより、化学的にコンピテントな大腸菌細胞を生成しました。。氷中に 20 分間放置した後、5000 rpm、4 °C で 5 分間の遠心分離によって細胞を回収し、4 mL の氷冷 CaCl2 に懸濁しました。サンプルを 300 μL ずつに分配し、DNA を加えて氷上で 40 分間インキュベートしました。細胞に 42 °C で 2 分間ヒートショックを与え、氷の中に入れました。形質転換体は、20 g L-1 バクトトリプトン、5 g L-1 酵母エキス、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4 および 20 mM グルコースを含む 500 μL の予熱した SOC 培地を加えることによって回収しました。選択 LB 寒天プレート全体に広げる前に、37 °C、250 rpm で 1 時間インキュベートします。次いで、ｐＧＥＸ－ｓｓｎＡプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州ラホーヤ）に移した。 GST-SsnA の発現は、1 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (Sigma Aldrich) により 37 °C で 4 時間誘導されました。グルタチオンセファロースカラムを使用して、１０ｍＭグルタチオン、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２、１ｍＭＤＴＴ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）中でＧＳＴ−ＳｓｎＡを溶出した。精製された GST-SsnA のサイズと活性を評価するために、SDS-PAGE およびクーマシーブリリアントブルー染色およびザイモグラフィーを実行しました。

N末端の26 kDa GSTタンパク質タグはトロンビンによって切断されました。 GST タグの最適な切断のために、精製 SsnA を溶出バッファーから TNC バッファー (20 mM Tris-HCl [pH 7.5]、50 mM NaCl、および 1 mM CaCl2) に交換しました。サンプルは、0.025 mgのSsnAごとに1 Uのウシトロンビン（Sigma）とともに室温で24時間インキュベートされました。トロンビンは、0.3 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド (PMSF) を添加して不活化し、37 °C で 15 分間インキュベートしました。

混合種の小宇宙バイオフィルムの成長では、過去 1 時間以内に飲食（水を除く）をしておらず、過去 3 週間に抗生物質を服用していない健康なボランティアから唾液を収集しました。唾液収集の倫理的承認は、ニューカッスル大学医科学部倫理委員会によって与えられました (ref. 1853/519/2020)。必要に応じて、唾液をジチオスレイトールで処理し、遠心分離によって沈殿物を除去し、ろ過によって唾液を滅菌して、無細胞唾液（CFS）73を作成しました。 BioFlux 1000 (Fluxion、カリフォルニア州サンフランシスコ) を使用して、混合種の口腔小宇宙バイオフィルムを成長させました。接種前に、BioFluxデュアルフロー24ウェルプレート(Fluxion)のチャネルを、200μLの無細胞唾液(CFS)を添加し、室温で20分間インキュベートすることによってプライミングした。次いで、過剰なCFSを出口ウェルから除去し、100μLの未処理の唾液と置き換えた。出口から入口への流れを 1.0 dyn/cm2 で 6 秒間開始しました。次にプレートを 37 °C で 40 分間インキュベートして播種を行わせました。次に、各入口ウェルをあらかじめ温めた (37 °C) CFS で満たし、37 °C、0.5 dyn/cm2 で 18 時間流れを開始し、10 分ごとに画像を撮影しました。必要に応じて、入口ウェル内の CFS に 2% スクロースまたは DNase 酵素を補充しました。使用したDNase酵素は、ウシDNase I (Sigma Aldrich)、Bacillus licheniformis NucB67およびS. gordonii SsnAでした。これらを５μＭの濃度で注入口に添加した。 eDNA を視覚化するために、CFS とともに 2.4 nM Yoyo-1 (LifeTechnologies) 色素を両方の入口ウェルに含めました。

BioFlux 1000 で成長したバイオフィルムのイメージングは、環境エンクロージャを備えた Zeiss Axio Observer Z1 顕微鏡で構成される BioFlux 1000Z イメージングワークステーションを使用して実行されました。画像の取得には、Hamamatsu カメラ (ORCA-Flash 4.0 LT: 4.2 メガピクセル、6.5 ミクロンピクセル) および BioFlux Montage ソフトウェア (Fluxion) を使用しました。画像は、ImageJ v.1.48 (国立衛生研究所) を使用して分析されました74。

各チャンネルのタイムラプス画像をスタックに変換しました。各スタックは、「Otsu」アルゴリズムを使用して自動しきい値処理されました。 w = 1000 h = 200 ピクセル (ストック画像サイズ 1024 × 1024 ピクセル) の長方形が選択され、関心領域 (ROI) として保存されました。平均ピクセル強度（平均グレー値）をスライスごとに測定し、SigmaPlot 13.0 ソフトウェア（Systat Software、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を使用してプロットしました。

共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で静的バイオフィルムを視覚化するために、染色されたカバーガラスを PBS ですすぎ、顕微鏡スライド上に固定された PBS を満たしたゴムフレーム上に反転させました。イメージングは、CFI PLAN APO VC 対物レンズ (Nikon 60x/1.40 Oil) を取り付けた Nikon A1R 共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して実行されました。画像は NIS-Elements C (v4.4、Nikon) ソフトウェアでキャプチャされ、Imaris (v8.2、Bitplane) ソフトウェアを使用して処理されました。

S. gordonii の細胞外 DNase 活性は、DNase Test agar (Sigma Aldrich、Gillingham、UK) を使用して評価しました。細菌培養物を DNase Test 寒天上に画線またはスポットし (10 μL)、37 °C で好気的に 48 時間インキュベートしました。 DNase テスト寒天培地中の DNA は、プレートを 1 N HCl で満たすことによって沈殿させました。

細菌培養物のヌクレアーゼ活性を測定するために、一晩培養物を pH 7.1 の PBS で 2 回洗浄し、光学密度 OD600 nm = 1 になるまで PBS に再懸濁しました。その後、Synergy HT を使用して、25 μL の細胞懸濁液について DNase 活性を測定しました。マイクロプレートリーダー (BioTek)。低 pH インキュベーション後の DNase 活性の回復をアッセイする実験では、THYE 培地で 37 °C で増殖させた S. gordonii DL1 細胞の一晩培養物を採取し、pH 4.5 緩衝液 (77.1 g/L 酢酸アンモニウム、７０ｍＬ／Ｌ氷酢酸）、ｐＨ５．５緩衝液（９６．３ｍＬの溶液Ｉ［１３．６１ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４（ＢＤＨ）］および３．６ｍＬの溶液ＩＩ［３５．８１ｇ／ＬＮａ２ＨＰＯ４］）およびＰＢＳ（ｐＨ７．１）。細胞を室温で最大 2 時間インキュベートし、PBS で洗浄し、新しい PBS に再懸濁し、25 μL アリコートを蛍光ベースの DNase 活性アッセイを使用して DNase 活性についてアッセイしました。 2時間後、細胞を回収し、pH 7.1のPBSで洗浄した。酸性緩衝液（pH 4.5 または 5.5）中でインキュベートした培養物を、収穫する前に等しい部分に分割しました。 1 つの部分を PBS に再懸濁し、もう 1 つの部分を 12.5 μg/mL クロラムフェニコールを含む PBS に再懸濁して、タンパク質の新規合成を阻害しました 75。培養物をさらに最大 2 時間インキュベートした後、DNase 活性を測定しました。

金属の存在下で精製 SsnA の活性を調べる場合、推定上の金属補因子を添加する前に、緩衝液の残留金属汚染物質または DNA 基質に結合した金属汚染物質をキレート化するために 40 μM EDTA を反応に含めました。 SsnA 酵素活性の最適 pH を決定するためにこのアッセイを使用した場合、次の緩衝液が使用されました: 酢酸ナトリウム三水和物緩衝液 (pH 4.5 ～ 5.5)、Bis-Tris (pH 6.0 ～ 6.5)、Tris-HCl (pH 7.0 ～ 9.0) ）および３－シクロヘキシルアミノ－１－プロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ９．７～１１．０）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）。

ザイモグラフィーを使用して、GST タグの有無にかかわらず、二本鎖 DNA に対する精製 SsnA の活性を評価しました。レムリ緩衝液中の酵素を、１００μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を含有する１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に（沸騰させずに）ロードした。電気泳動後、ゲルを酵素再活性化バッファー (40 mM Tris-HCl、5 mM CaCl2、5 mM MgCl2、および 3% 脱脂粉乳 [Premier International Foods, St. Albans, UK]) 中で 37°で 20 時間インキュベートしました。 C. ゲルを臭化エチジウム (0.5 μg mL-1) で 30 分間染色し、蒸留水で 15 分間ずつ 3 回洗浄しました。ゲルは、G:BOX トランスイルミネーター (Syngene) を使用して紫外光下で視覚化されました。

4 mL の細胞培養物を 4 mL RNAlater (Life Technologies) と混合し、チューブを 5 秒間ボルテックス混合し、20 °C で 5 分間インキュベートしました。インキュベーション後、細胞を 3800 g、20 °C で 15 分間回収し、上清を廃棄し、ペレットを -80 °C で 72 時間以内凍結し、RNA を抽出しました 76。サンプルを20℃で解凍し、500 U/mLのムタノリシンを加えた100μLのスフェロプラスト化バッファーに再懸濁しました。細胞を37℃で5分間インキュベートしました。全RNAは、Ambion RiboPure Bacteria RNA Purificationキット(Life Technologies)を製造業者の指示に従って使用して抽出した。 RNA 濃度は、NanoDrop ND-1000 分光光度計 (Nanodrop Technologies, LLC、米国デラウェア州ウィルミントン) を使用して測定しました。 RNA の完全性を確認するために、RNA をゲル電気泳動によって分析しました。細菌細胞からのトータル RNA 1 μg を、QuantiTect 逆転写キット (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を製造業者の指示に従って使用して逆転写した。

0.25μLのcDNAサンプル、QuantiTect SYBR Green mix（Qiagen）、1μMフォワードプライマーqRT-ssnAFおよびqRT-ssnARリバースプライマー（補足表2）を総量20μLに含むRT-qPCR反応混合物を調製しました。反応は、QuantStudio 3 (ThermoFisher Scientific、Waltham、マサチューセッツ州、米国) を使用し、次のサーモサイクリングプログラムで 3 回実行しました: 95 °C で 2 分間の初期変性、および 95 °C で 15 秒間の増幅を 40 サイクル、55 °C で 15 秒間増幅10 秒間および 72 °C で 30 秒間。比較 CT 法 (ΔΔCT) を使用して RT-qPCR データを分析し、データを参照として 16 S rRNA 遺伝子に対して正規化しました (補足表 2、qRT-16S-F および qRT-16S-F)。 RT-qPCR 反応は、融解曲線分析を使用して検証されました。

すべてのグラフはプロットされ、GraphPad Prism (GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホーヤ) バージョン 9 を使用して統計テストが実行されました。統計テストの詳細は図の凡例に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

主要原稿の数値を裏付ける定量的データは、ニューカッスル大学研究リポジトリ (https://doi.org/10.25405/data.ncl.21539340) で入手できます。その他のデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、国際歯科研究協会 (IADR) の口腔ケア革新賞 (NSJ) およびダンヒルメディカルトラスト (RPGF1810\101) (NSJ/AHN/KJW) によって資金提供されました。 KJW はバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会 (BB/S006818/1) から資金提供を受けました。 CL に対する博士号の資金提供は国立衛生研究所 (DE016690) から行われました。 Ekaterina Kozhevnikova 氏と Philip Hardy 氏の技術サポートと、ニューカッスル大学タンパク質およびプロテオーム解析 (NUPPA) コア施設の酵素精製への支援に感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Nadia Rostami、Robert C. Shields。

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アヒム・トロイマン

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ケビン・J・ウォルドロン

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NSJ、NR、AN、AT、KJW、および RCS が実験を計画しました。 NR、RCS、SY、CL、JLB、PT、HA が実験を実施しました。 NSJ、NR、AN、AT、KJW、および RCS がデータを分析および解釈しました。 NR、RCS、NSJ が原稿を起草しました。著者全員が原稿を批判的にレビューし、提出された最終版を承認しました。 NR と RCS は同様にこの作業に貢献しました。

ニコラス・S・ジャクボビッチへの通信。

ニューカッスル大学は、特許 WO2011098579A1「細菌デオキシリボヌクレアーゼ化合物およびバイオフィルム破壊および予防方法」を保有しています。他に競合する利害関係はありません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

ロスタミ、N.、シールズ、RC、セラージュ、HJ 他 Streptococcus gordonii 細胞外デオキシリボヌクレアーゼ SsnA によって媒介される口腔バイオフィルムにおける種間競合。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 8、96 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41522-022-00359-z

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受信日: 2021 年 11 月 15 日

受理日: 2022 年 11 月 21 日

公開日: 2022 年 12 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00359-z

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ストレプトコッカス・ゴルドニイ細胞外デオキシリボヌクレアーゼSsnAを介した口腔バイオフィルムにおける種間競合